[생공실1] 결과레포트 Recombinant protein overexpression in E. coli strains, Protein purification(Affinity chromatography)

목차
1. Title
2. Materials & Methods
3. Result
4. Discussion
5. Reference

1. Title

 Recombinant protein overexpression in E.coli strains, Protein purification(Affinity chromatography)

 

2. Materials & Methods

- Recombinant protein overexpression in E.coli strains

 <Materials>

  IPTG, Lysis buffer, LB broth, 50ml tube, 1L 삼각 플라스크, 에이드

 <Methods>

  1. Recombinant plasmid를 BL21(DE3) strain에 transformation 시킨다.

  2. Transformation된 BL21(DE3) strain을 5ml LB broth에 shaker incubator에 37도 O/N incubation시킨다.

  3. O/N 시킨 sample 200ul을 삼각 플라스크에 200ml scale up Fresh culture 37도 2hr incubation시킨다.

  4.10uM농도로 IPTG induction 37eh 5hr induction시킨다.

  5. induction이 끝난 sample을 50ml tube 4개에 옮기고 4000rpm 10min 4도centrifugation 후 supernatant버린다.

  6. pellet을 lysis buffer 5ml로 풀어준 후 sonication 해준다.

  7. sonication이 끝난 sample을 EP tube에 옮긴 후 13000rpm 30min 4도 centrifugation 후 supernatant, pellet 나누어 sampling해준다.

 

- Protein purification(Affinity chromatography)

<Materials>

  50% Ni-NTA, 정제할 protein sample, column, EP tube, lysis buffer, wash buffer, elution buffer

<Methods>

  1. EP tube에 1ml Ni-NTA Slurry를 옮긴다.

  2. 130000rpm 4도 1min centrifugation 후 supernatant 버린다.

  3. Lysis buffer 1ml로 washing 후 13000rpm 4도 1min centrifugation x2

  4. Column 준비 후 lysis buffer 5ml로 적셔준 후 밑에 뚜껑 열러 흘려준다.

  5. Ni-NTA solution을 column에 적신 후 밑에 뚜껑 열어 2/3정도 흘려준다.

  6. 정제할 protein sample 4ml 넣고 30min incubation.

  7. 밑에 뚜껑 열고 Flow through를  EP tube에 얻는다.

  8. F/T 다 흘리고 wash buffer 4ml씩 2번 흘려준다.

  9. Elution buffer 1ml 넣고 300ul씩 EP tube에 얻는다.x3

  10. 얻은 sample들을 Coomassie blue로 결과 확인(정제 전 sup, F/T, Elution1/2/3)

 

3. Result

<figure1. protein purification(Affinity chromatography)결과값>

점같이 찍힌 부분이 있는데 affinity chromatograpthy과정 중에 생긴 불순물이 표시된 것 같다.

 

4. Discussion

 이번 실험은 E.coli에서 overexpression을 이용하여 얻은 protein을 affinity chromatography실험기법을 이용하여 단백질을 purification해보는 실험이었다. 시간이 많이 걸리는 실험이니만큼 2주에 걸쳐서 진행되었다. 먼저 앞서서 purification라는 것에 대해 알아보자면 정제라는 의미로서 우리가 정제과정을 진행시켜 나갈수록 얻어지는 target protein의 순도가 점점 높아져야한다는것이다. 이러한 원리를 중심삼아 지금부터 purification결과를 토대로 실험에 대해 고찰해보자.

 

 Affinity chromatography를 통해 elution된 sample들(정제 전 sup, F/T, Elution1/2/3)의 결과값은 figure.1과 같다.

 정제전 sup의 band의 값을 보면 다양한 크기의 단백질이 있음을 볼 수 있다. 마찬가지로 F/T(flow through)값을 보면 정제전 sup의 band와 비슷하게 많은 단백질이 있다는 것을 볼 수 있다.

 elution1의 값을 보면 원하는 band외데 다른 band도 희미하게 보이는 것으로 보아 다른 단백질이 sample에 섞여 있었다는것을 의미한다. 즉 affinity chromatography를 통해서 원하는 단백질만 정제된 것이 아니라 그 외의 다른 단백질도 함께 섞여 나왔다는 것을 의미한다. 이것의 가장 큰 이유는 sample을 elution을 통해 얻은 것이기때문에 모든 sample의 concentration이 일정하다고 간주할 수 없기때문이다.

 elution2도 elution1의 band값과 유사한 결과가 나왔다. 이런 값이 나왔을지 생각해보면 elution을 2번째 했을 때 전의 elution buffer가 포함되있어 elution1의 값과 비슷한 결과가 나온것같다.

 elution3의 band는 affinity chromatography의 실험 목적에 맞게 원하는 단백질만 잘 나왔다는 것을 figure.1을 보면 알 수 있다.

 

 원하는 단백질만 얻기위해 affinity chromatography를 했지만 다른 단백질들이 보이는 경우 이 band를 없애주기 위해서는 affinity chromatography를 한 다음 second step purification을 해야 할 것이다.

 

 정리해보자면, 이번 실험 결과를 토대로 볼 때 우리조의 경우 실험이 100% 완벽하게 진행되었다고 보기 어렵다. 실험 과정에서 발생한 실수를 줄이고 정확하게 실험하여 정확한 실험결과값이 얻어질 수 있도록 노력해야 할 것이다.

 

5. Reference

 Despo Papachristodoulou, 2017, 생화학과 분자생물학, 신일서적, p.78-80

Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., & Maertens, B. (2015). Purification of His-tagged proteins. Methods in Enzymology, 559, 1–15.