[생공실1] 예비레포트 Protein purification (Affinity chromatography)

목차
1. Title
2. Purpose
3. Introduction
4. Reference

 

1. Title

 Protein purification (Affinity chromatography)

 

2. Purpose

affinity chromatography에 대해, His purification에 대해, 그리고 protein induction 조건과 protein의 solubility에 대해 알아본다.

 

3. Introduction

 크로마토그래피라는 용어는  혼합물의 구성요소를 두 상 사이의 분할에 기초하여 분리하는 분석 및 전처리기술에서 널리 사용된다. 고체 매트릭스가 정지상으로, 단백질을 분질할 때에는 보통 기체보다 액체가 이동상으로 사용되어 크로마토그래피를 통과하여 흐른다. 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼은 정지상의 매트릭스로 가득 채워져 있고, 취급할 시료가 칼럼 상부에서 들어간 후 이동상에 의해서 씻겨진다. 칼럼에서 나온 용출액의 부분들이 모여서, 관심있는 단백질이 분석된다.

 그 중 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)는 매우 강력한 정제 기술이 될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 천연분자 리간드와 단백질 간의 비공유결합을 이용하는 것이다. 그러나 특정 리간드가 붙어있는 칼럼매트릭스를 만드는 것은 기술적으로 힘들고 비쌀 수 있다. 이러한 문제점을 피하기 위한 기술의 변화는 재조합 DNA방법으로 대장균에서 관심 단백질을 생산하는 것으로, 여기서는 쉽게 선택하능한 꼬리표(tag)를 단백질에 설계할 수 있다.

 

 His-tagged proteins의 Ni-NTA affinity purification은 bind-wash-elute procedure이다. 이것은 native 또는 denaturing conditions하에 수행 될 수 있다. His-tag/Ni-NTA는 6개 혹은 8개의 히스티딘을 연속으로 달아놓으면 니켈 등의 금속이온과 배위결합을 생성하게 된다. 니켈이 레진에 결합되어 있으면 히스티딘을 쭉 달아 니켈 결합 레진에 단백질이 달라붙게 되는 이러한 성질(Ni고정-NTA사용)을 이용하여 단백질을 정제하는 방법이다.

 

 Protein induction은 원하는 유전자 plasmid를 E.coli에 과발현 시켜 원하는 단백질만을 얻어내고자 하는 것이다. IPTG 유도(IPTG induction)을 하려면, 무균의 필터 여과한 1M농도의 IPTG가 일반적으로 1:1000 희석 농도로 대수적(logaritmically)으로 성장중인 세균배양액에 더해져야한다. 그렇긴하지만 IPTG최종농도는 다르게도 쓸 수 있다.

 

 Protein의 solubility, 즉 solubility라는 것은 target단백질만을 발현했을 때는 활성이 없는 불활성결정체로 잘현되어 축적되지만 fusion tag을 붙였을 때는 구조와 활성을 유지하는 상태로 발현이 되는 것을 의미한다. 정제를 할 때 물에 녹은 상태(soluble)에 있어야 수용액 상태의 단백질을 얻을 수 있고 solubility가 0이라면 그 단백질을 정제할 가능성이 없을 수 있어 affinity chromotography방법으로 정제를 하거나, size에 의해 분리를 해야한다. 단백질이 soluble하게 존재해야 되는 점을 고려해보면 protein의 solubility가 중요하다는 것을 할 수 있다. 

 solubility를 높일수 있는 방법으로는 Tag이 큰 vector를 사용하는것이다.(HIS.GST.MBP>...) 또한 저온에서 발현시키거나 천천히 발현시키는것과 chaperone plasmid사용 등이 있다.

 

 

4. Reference

Despo Papachristodoulou, 2017, 생화학과 분자생물학, 신일서적, p.78-80

Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., & Maertens, B. (2015). Purification of His-tagged proteins. Methods in Enzymology, 559, 1–15.