예비레포트 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)를 위한gel 제작
| SDS-PAGE gel 조성 및 각각의 역할에 대해 알 수 있다. |
| 어떤 단백질 혼합용액으로부터 각각의 단백질을 분리할 때에, 분자량, 등전점의 차이를 이용하는 것은 효과적인 수단이 된다. 겔을 이용한 전기영동법은 분리 후의 단백질을 염색함으로써 band또는 spot으로서 확인할 수 있으며, 또한 얻어진 겔 상의 위치정보는, 겔로부터 추출하여 동정한 단백질이 정확한지, 어떤 지에 대한 기준이 된다. SDS-PAGE는Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis으로 음이온 계면활성제인 도델실황산나트륨(SDS)의 존재하에서 실시하는 폴리아크릴아미드겔 전기영동의 1종이다. 2-메르캅토에탄올 등으로 S-S결합을 절단한 대부분의 단백질은 SDS용액 속에서 1g당 약 1.4g의 SDS와 결합하여 전하밀도가 거의 일정한 복합체를 형성한다. 이 때문에 겔내에서 전기영동을 할 때의 이동속도는 단백질의 분자량에 의해 결정된다. 따라서 분자량이 이미 알려진 표준단백질을 사용하면 단백질의 분자량을 신속하고 간편하게 추정할 수 있다. 이제 SDS-PAGE에 대해 자세히 알아보도록한다. 1. SDS-PAGE란 1) SDS(Sodium dodecyl sulfate) : 음이온성 계면활성제의 일종으로 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만들어주는 역할을 하며, SDS분자의 긴 소수성 꼬리가 단백질의 골격을 감싸면서 음전하를 띈 고리의 끝부분이 밖으로 향하게 되므로 단백질은 본래 가지고 있던 전하와 상관없이 -전하를 띄게 된다. 2) PAGE(Poly arcylamide gel electrophoresis) : acrylamide의 중합반응으로 만들어진 gel을 이용한 전기영동법을 말한다. 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세통로의 크기를 조절할 수 있기 때문에 다양한 크기의 생체 분자들을 분리하면서 높은 정밀도와 고분해능으로 널리 사용되어지고 있다. 2. gel의 조성 1) stacking gel의 역할 : stacking gel 에는 SDS 가 들어있기 때문에 이것이 각각의 단백질들을 코팅하여 -전하를 띄게 하며, 낮은 pH에 의해서 단백질들의 결합을 분리하여 seperating gel 위의 동일 선상에 정렬하여 동일 선상에서 출발할 수 있도록하는 역할을 한다. 2) seperating gel : seperating gel은 각각의 단백질의 MW의 차이에 의해서 나뉘게한다. 질량이 큰 것은 천천히 내려가고, 질량이 가벼운 것은 빨리 내려 감으로써 각각의 단백질들을 나뉘어 주게 된다. 3) seperating gel과 stacking gel만들 때pH가 다른 이유 : 보통 SDS-PAGE는 두가지의 다른 gel이 붙어있는 상태인 Disc gel 전기영동으로 시행하게 된다. 단백질 시료가 gel에 apply되었을 때 모든 시료가 같은점에서 출발할 수 있도록 압축되고 그 다음에 따라 성질에 따라 분리되 게 된다. 이렇기 때문에 두 gel의 농도나 pH가 다르게 설정되어 있다. 윗부분의 gel은 stacking gel이라 하고, acrylamide 농도는 주로 3~5%이고 pH는 6.5를 주로 쓰게된다. 아래부분의 gel은 separating gel이나 running gel, resolving gel등으로 불리고 acrylamide 농도는 분리하고자 하는 단백질의 크기에 따라서 6~15%를 사용하게된다. |
| Reference : 강호일, 2007, 단백질 실험 핸드북, 월드사이언스, page56-65 하정욱, 2003, 식품화학실험, 형설출판사, page350-358 아카데미서적 편집부, 2003, 아카데미 생명과학사전, page760 |
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